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副溶血弧菌导致南美白对虾败血病的研究


中国养殖信息网 2008/7/9 11:45:12 点击次数:6629 录入:李清

  摘 要 本文通过对南美白对虾败血病病原菌的分离培养、人工感染试验和详细的生理生化测定,确定副溶血弧菌为此败血病的病原菌。
  关键词 南美白对虾 败血病 副溶血弧菌
 
  南美白对虾(Penaeus vannamei)又称凡纳对虾、万氏对虾,原产于南美洲的沿海水域,具有适应能力强、耐盐性广、生长迅速、繁殖期长、肉味鲜美、加工出口率高等优点,深受养殖户和消费者欢迎。近两年随着南美白对虾养殖业的迅猛发展,病害频繁出现,有的甚至造成毁灭性打击。败血病是一种南美白对虾养殖过程中广泛流行的疾病,其特点是发病快、死亡率高、危害严重。笔者对此病进行了病原菌的分离培养、人工感染试验和详细的生理生化测定,试验情况和结果报道如下:
 
1 材料和方法
1.1 试验用病虾的来源
  病虾取自广西钦州地区南美白对虾养殖场的自然发病池,选取有典型症状的濒死病虾作为试验材料。病虾主要外观症状为:附肢变红,特别是游泳足变红,头胸甲鳃区呈黄色或浅红色,肝胰脏和心脏颜色变浅,轮廓不清,甚至溃烂或萎缩。病虾表现为离群独游,行动呆滞,不能控制行动方向。
1.2 病原菌分离和鉴定
  按无菌操作从肌肉、心脏和肝脏等内脏器官挑取病料分别划线接种于2216E和TCBS培养基上,置28℃恒温箱中培养24h后,选取形态、色泽一致占优势的菌落重复划线分离,获得纯培养,然后按照中科院微生物研究所细菌分类组编著的《一般细菌常用鉴定方法》[1]和韩文瑜等编著的《病原细菌检验技术》2]进行生物学性状测定。根据Krieg和Holt分类法鉴定至种[3]
1.3 人工感染试验
  试验虾在水族箱中暂养1d,然后选取健壮、无病症表现、个体大小相近者,随机取样分组,在塑料水槽中进行感染试验。每槽为一组,每组8尾,所用菌均为在斜面培养基上培养24h后,用无菌生理盐水洗脱,稀释至所需浓度的菌悬液。1.3.1 注射感染
用70%酒精棉球在虾体侧消毒后,用灭菌注射器将不同浓度的菌悬液对虾体分别进行肌肉注射,每尾虾注射0.1ml,对照组注射0.1ml的无菌生理盐水。
1.3.2 浸泡感染
  将菌液加到塑料水槽中制成所需浓度,对照组不加菌液,然后将试验虾置于其中。
1.3.3 创伤感染
  用消毒剪剪去一组虾的一角尾扇,另一组剪去1~2片鳃丝,试验虾放入塑料水槽中,加菌液制成所需浓度。
1.3.4 口服感染
  用无菌生理盐水洗脱培养24h的病原菌,每1ml菌悬液(含菌量1×109个/ml左右)与2g饵料均匀混合,静止吸附10min后投喂,每天投喂2次,每槽每次1g,并及时吸去残饵,对照组的饵料不加菌悬液。
1.3.5 重复分离和重复感染
  从肌肉注射感染病的试验虾中,选取症状明显的濒死病虾,用其脏器分离病原菌单株,挑取与原感染试验形态相一致的纯培养菌株,经肌肉注射作重复感染试验。
 
2 结果
2.1 人工感染试验
  人工感染试验结果列于表1~5。由表1可以看出,当菌悬液浓度为3.6×108个/ml时,第1d便全部死亡;当菌液浓度为3.6×107个/ml和3.6×106个/ml时,死亡率分别为87.5%和62.5%,随着菌液浓度的降低,感染虾死亡时间拖后并延长。由表2(1组为尾扇创伤,2组为鳃创伤)可以看出,由鳃创伤感染率高,由尾创伤感染率低。由表3可以看出,当水中菌浓度达到一定值时,能使部分虾在短时间内受感染,但感染率较低。口服感染试验在投喂2~3d后便出现死亡(表4)。对注射感染后具有典型症状的病虾进行重复分离,得到与感染菌株形态相同的菌种,用它进行重复感染试验的结果显示,当菌液浓度达到1×108个/ml时,试验虾死亡率为100%,随着菌液浓度降低,试验虾死亡率降低(见表5)。
表1            分离菌株肌肉注射法感染南美白对虾的观察
菌号
组别
菌液浓度(个/ml)
试验天数及死亡数(尾)
死亡率(%)
1
2
3
4
5
6
7(d)
合计
602
1
3.6×108
8
0
0
0
0
0
0
8
100
2
3.6×107
3
2
1
0
1
0
0
7
87.5
3
3.6×106
2
2
0
1
0
0
0
5
62.5
对照组
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
 
 
表2               分离菌株创伤感染南美白对虾的观察
菌号
组别
菌液浓度(个/ml)
试验天数及死亡数(尾)
死亡率(%)
1
2
3
4
5
6
7(d)
合计
602
1
9×108
0
1
0
0
0
1
0
2
25
2
9×108
1
1
0
1
0
0
0
3
37.5
对照组
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
 
表3               分离菌株浸泡感染南美白对虾的观察
菌号
菌液浓度(个/ml)
试验天数及死亡数(尾)
死亡率(%)
1
2
3
4
5
6
7(d)
合计
602
9×108
0
0
0
0
1
0
0
1
12.5
对照
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
 
 
表4                 分离菌株口服感染南美白对虾的观察
菌号
菌液浓度(个/ml)
试验天数及死亡数(尾)
死亡率(%)
1
2
3
4
5
6
7(d)
合计
602
1×109
0
2
1
0
0
1
0
4
50
对照
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
 
表5              重复分离菌株肌肉注射感染南美白对虾的观察
菌号
组别
菌液浓度
(个/ml)
试验天数及死亡数(尾)
死亡率(%)
1
2
3
4
5
6
7(d)
合计
602-B
1
1.8×108
4
2
1
1
0
0
0
8
100
2
1.8×107
2
1
2
0
0
1
0
6
75
3
1.8×106
1
0
2
0
1
0
0
4
50
对照组
生理盐水
0
0
0
0
0
0
0
0
0
 
2.2 病原菌的鉴定
  对602菌株及注射感染后自病虾体内重新分离出的602-B菌株进行了形态及生理、生化特征测定,602和602-B菌在2216E培养基上形成圆形、表面光滑、边缘整齐、微凸、半透明的菌落。在TCBS培养基上形成的菌落为绿色。2株菌均为革兰氏阴性、无芽胞、无荚膜、运动活泼的弧形菌,氧化酶、过氧化氢酶阳性。
  根据病原菌的形态和生理生化特征的测定,602和602-B菌被鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),详细特征列于表6。
 
表6                       分离菌株的特性*
测定项目
菌株602和602-B
测定项目
菌株602和602-B
革兰氏染色
-
葡萄糖产气
-
单极毛
+
发酵
 
动力
+
葡萄糖
+
TCBS上颜色
G
阿拉伯糖
-
氧化酶
+
蔗糖
-
过氧化氢酶
+
甘露糖
+
0/129
S
甘露醇
+
水解淀粉
+
肌醇
-
水解明胶
+
棉子糖
-
甲基红
+
赖氨糖脱羧酶
+
V.P
-
鸟氨酸脱羧酶
+
吲哚
+
精氨酸双水解
-
硫化氢
-
无NaCl胨水生长
-
温度4℃生长
-
3%NaCl胨水生长
+
温度10℃生长
+
7%NaCl胨水生长
+
温度30℃生长
+
10%NaCl胨水生长
-
温度42℃生长
+
淀粉水解
+
 
3 讨论
  本试验从患败血症的南美白对虾中分离到副溶血弧菌,这种菌可引起健康虾出现与自然病例相似的症状并引起死亡,同时从死亡虾体内可重复分离到这种菌,因此可以确定副溶血弧菌是此败血病的病原菌。
  细菌尤其是水生弧菌对虾体的毒力早已被证实[4,7],这些细菌都是水环境中的正常菌群成员,它们是条件致病菌[5,6],其致病性取决于宿主的生理状态、海水中的细菌数量及环境条件等。引起南美白对虾败血病的外部诱因可能是由于水质恶化、水温突然升高等环境条件的改变或虾体损伤、抵抗力下降时受到条件性致病的副溶血弧菌感染,病原菌由感染部位进入血液,并在血液中繁殖,逐渐增强毒力,达到一定程度时导致败血病发生。其结果是一方面血管受损引起渗出或广泛性出血,另一方面随着血流进入内脏器官的病菌使心脏、肝胰脏和鳃等受到损害,从而发生变性、坏死和发炎。病虾由于缺血、缺氧以及血液循环和呼吸、消化、排泄机能不正常,最终导致虾体衰竭而死亡,滞留在体表感染部位的病菌则在局部组织引起病变,从而出现充血和出血的外观症状。
  从人工感染试验结果看,此种病原菌主要经口传播,另外经体表或体表创伤亦能入侵虾体。在实际养殖过程中,败血病的突发性很强,一旦感染,条件适宜病原菌大量生长时,就会爆发大批死亡。因此应坚持“以防为主,防重于治”的方针,保持良好的养殖生态环境[8],如水质清新、溶氧充足、水温稳定等。定期进行虾体和水体消毒,强化饲养管理,不投喂腐烂变质、不洁的饵料,并常用一些广谱性抗菌药物拌饵投喂,尽可能减少南美白对虾败血病的发生。

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